GB/T 14926.50-2001 实验动物 酶联免疫吸附试验

前言

本标准修订了 GB/T 14926.18-1994《实验动物淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒检测方法》中的酶联免疫吸附试验方法,将其作为一个独立标准列出。

本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口，

本标准起草单位:中国实验动物学会。

本标准主要起草人:贺争鸣。

范围

本标准规定了酶联免疫吸附试验(ELISA)所用试剂、器材和操作步骤等。

本标准适用于实验动物病毒抗体的检测。

原理

包被于固相载体表面的已知抗原与待检血清中的特异性抗体结合形成免疫复合物。此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性,可与相应的第二抗体酶结合物结合。在酶的催化作用下底物发生反应,产生有色物质。颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比。

3 主要试剂和器材

3.1 试剂

3.1.1 抗原

3.1.1.1 特异性抗原

将病毒接种其敏感细胞培养增殖(表 1),当细胞病变达十十十~十十十十时收获,冻融三次或超声波处理后,低速离心去除细胞碎片,上清液再经超速离心浓缩后制成 ELISA 抗原。3.1.1.2 正常抗原

未接种病毒的相应细胞冻融破碎后,经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液。3.1.2 酶结合物

ELISA 法常用以下两类酶结合物。

3.1.2.1 辣根过氧化物酶标记羊或免抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、免、犬或猴IG抗体。用于检测相应动物血清抗体。

3.1.2.2 辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白 A(SPA)。用于检测小鼠、豚鼠、免、犬和猴血清抗体。

3.1.3 对照血清

3.1.3.1 阳性血清

用病毒抗原免疫清洁或 SPF 小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或普通级免、犬、猴所获得的抗血清:或自然感染恢复后的犬、猴血清。

3.1.3.2 阴性血清

清洁或 SPF 小鼠、大鼠、豚鼠,地鼠血清;或确认无相应病毒感染的免、犬、猴血清。3.1.4 包被液(0.05 mol/LpH9.6)

碳酸钠

1.59 g

碳酸氢钠

蒸馏水

2.93 g

加至1000 mL

3.1.5 PBS(0.01 mol/L pH7.4)

3.2 器材

3.2.1酶标仪。

3.2.2聚苯乙烯板:40 孔、55 孔或 96孔(可拆或不可拆),用前洗净晾干,在紫外线下 20 cm 处照射1 h。

微量加样器:容量 5~50 μL、50~200 μ。3. 2.33.2.4 37℃培养箱。

操作步骤

4、1包被抗原

根据滴定的最适工作浓度,将特异性抗原和正常抗原分别用包被液稀释。每孔100L,置37℃1h后再 4℃过夜。

用洗涤液洗5次,每次3min,叩干。4.2

4.3 加样

待检血清和阴性、阳性对照血清分别用稀释液做1:40稀释,分别加人两孔(特异性抗原孔和正常抗原孔),每孔 100 L,37℃1h,洗涤同上。

4.4 加酶结合物

用稀释液将酶结合物稀释成适当浓度,每孔加入100L,37℃1h,洗涤同上。4.5 加底物溶液

每孔加入新配制的底物溶液 100 μL,置 37℃,避光显色 10~15 min。终止反应4.6

每孔加人终止液 50 μL。

47测A值

在酶标仪上,于490 nm 处读出各孔 A值。

结果判定

在阴性和阳性对照血清成立的条件下,进行结果判定。

5.1 同时符合下列3个条件者,判为阳性。

5.1.1 待检血清与正常抗原和特异性抗原反应有明显的颜色区别;

5.1.2待检血清与特异性抗原反应的A值≥0.2:

5.1.3 待检血清与特异性抗原反应的 A值/阴性对照血清与特异性抗原反应的 A值≥2.1。

5.2 均不符合上述3个条件者,判为阴性。

5.3 仅有1~2条符合者,判为可疑。需选用同一种方法或另一种方法重试。