丹栀逍遥散对饮水冲突天敌暴露模型大鼠行为学影响

摘要：目的探讨丹栀逍遥散对广泛性焦虑障碍的作用机制。方法观察丹栀逍遥散对饮水冲突联合天敌暴露应激焦虑模型大鼠行为学的影响。30只大鼠随机分为正常组、模型组、中药组，于造模结束前7d开始中药干预。除正常组外，其余2组采用饮水冲突法联合天敌暴露法建立应激焦虑大鼠模型，期间2种造模方法交替进行20d。最后1次应激结束之后，于24h后记录观察药物干预后，各组大鼠在旷场实验和高架十字迷宫测试结果的异同。结果最后1次复合应激结束24h之后，相对于正常组，模型组大鼠，水平、垂直运动次数减少，OE％和OT％比例下降；相对于模型组，中药组大鼠，水平、垂直运动次数增加，OE％和OT％比例上升，除OT％外以上结果均有显著差异。结论丹栀逍遥散对于饮水冲突天敌暴露应激焦虑模型大鼠表现有明显抗焦虑作用。

关键词：天敌暴露；饮水冲突；广泛性焦虑障碍；丹栀逍遥散；行为学；大鼠

广泛性焦虑障碍(generalizedanexietydisorder，GAD)是最常见的一种焦虑障碍，以持续、过度、不可控制的焦虑情绪和担忧为其主要症状。焦虑动物模型是研究广泛性焦虑障碍不可或缺的途径之一，它是抗焦虑药物筛选、药物抗焦虑机制研究的重要工具。研究发现，中药丹栀逍遥散可以调节广泛性焦虑模型大鼠cAMP通路中信号因子、调节中枢神经系统兴奋与抑制的过程，影响神经递质代谢及神经元的凋亡等作用，临床基础研究方面证实，丹栀逍遥散可以明显改善焦虑症患者的临床焦虑症状，疗效确切。
根据天敌暴露法以及Vogel饮水冲突法，建立复合应激焦虑大鼠模型，通过测评旷场实验(open．fieldtest，OFT)和国际公认的高架十字迷宫(elevatedplusmaze，EPM)行为变化探讨丹栀逍遥散方对广泛性焦虑障碍的作用。
1材料
1．1动物和分组
健康的雄性wistar大鼠30只，SPF级别，体重(200±10)g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。许可证号SCXK(京2012-0001)。动物购进后预养1周，正常饮食水。光照节律12D／12L
(8：00～20：00)，室温(22±2)oC，相对湿度45％一60％。实验动物经过1周预养之后进行随机分组，分为正常组、模型组和中药组，每组10只。
1．2药物
丹桅逍遥散：柴胡15g、桅子1Og、丹皮10g、炒白术15g等。北京中医药大学第三临床医学院提供，按照灌胃剂量浓缩，浓度1．05g／mL，贮存于4℃冰箱备用，用前加热。
1．3实验装置及行为学测仪器
饮水电击箱(由上海欣软信息科技有限公司生产)，旷场实验测试箱(由上海欣软信息科技有限公司生产)，高架十字迷宫(由上海欣软信息科技有限公司生产)，铁丝网猫箱(50cm×50cm×50cm)1个，铁丝网鼠笼(20cm×10cm×10cm)2个。

2方法
2．1饮水冲突联合天敌暴露焦虑模型建立除正常组给予正常饮水摄食，模型组交替使用Vogel饮水冲突实验J、天敌暴露实验20d，每天使用其中的1种。于造模结束前7d开始给予中药干预，中药组给予丹栀逍遥散1O．5g／kg灌胃，模型组给予等量蒸馏水灌胃，每天1次，连续给药7d。
2．1．1饮水冲突实验：大鼠先剥夺饮水24h后，再允许饮水，每当舔吸管口20次，给予相当于50V的电击2sec，电流通过笼子底部的铁栅栏连接。电击导致动物舔吸行为减少，从而产生条件化恐惧，引起焦虑，每次实验3min。

2．1．2天敌暴露：按照文献[6]采用猫暴露实验。
每天仅让猫进食30g小鼠1只，确保猫始终处于饥饿状态，维持对大鼠固有的攻击性。大鼠放入鼠笼后置于猫笼内，将猫引入猫笼，每次实验持续45min。由于铁丝网的阻挡，猫无法接触到大鼠，但大鼠可以通过视觉、嗅觉以及听觉体验到猫的存在，大鼠表现出明显的焦虑样行为，如四处逃窜或行动减少、蹲伏、动作僵硬等。
2．2行为学测评
最后1次应激结束24h之后，分别进行旷场实验和高架十字迷宫测试。测试过程中，保持实验室光线昏暗(以摄像头能准确分辨大鼠轮廓为准)，安静。观察人员2名，室内负责动物搬运人员1名，测试过程中保持安静；每只大鼠测试完毕后，需清理实验装置内大鼠残留尿液、粪便等，以避免噪音、气味等因素影响实验结果。
2．2．1旷场实验：用于活动性和探究行为评价。采用立方体木敞箱J，大小100cm×100cm×50m，周壁、底面为黑色，底面用白线划分成面积相等的25块方格，沿墙格称外周格，其余为中央格。将大鼠置于敞箱底面的中心方格内，1名观察人员记录水平运动次数，另1名观察人员记录垂直运动次数。以动物穿越底面的格数为水平运动次数，以后肢直立次数两前爪腾空或攀附箱壁)为垂直运动次数。测定时间5min，每只大鼠测定1次。水平运动次数计分标准：大鼠1／2以上身体从所在方格进入相邻方格即爬越1次，计1分，所得总分用于评价其运动活性改变；垂直运动次数计分标准：两前肢离地1cm以上，后肢性站立1次计1分，总分用于评价其探究行为改变。

2．2．2高架十字迷宫测试：用于焦虑程度评价。采用国际通用方法j，迷宫由2个相对的开放臂(openarn3s，50cm×10cm)和2个相对的闭合臂(enclosearms，50cm×10cm×40cm)组成，闭合臂上部不封顶，迷宫中央为10cm×10cm的开阔部分。单盲，2位观察者分别观察每组50％的动物。大鼠从中央区面向闭合臂放入迷宫，记录5min内活动的情况；1名观察人员记录大鼠开放臂活动情况，另1名观察人员记录大鼠闭合臂活动情况。观察指标：大鼠开放臂进人次数(openarmentry，OE)，开放臂停留时间(openarmtime，OT)，闭合臂进入次数(closeannentry，CE，必须有2只前爪进人臂内)，闭合臂停留时间(closearmtime，CT)，2臂总次数(totalen．try，TE)，2臂总时间(totaltime，1Tr)。计算大鼠进入开放臂的次数占两臂总次数的百分比(OE％)和开臂滞留时间占总时间的百分比(OT％)。

2．3统计方法
各组数据用均数±标准差(元±s)表示。数据处理采用SPSS统计软件分析处理，采用One．wayANOVA方差分析进行数据处理，各组均数间的多重比较采用LSD法，如果方差不齐则用Welch法，各组间多重比较采用dunnett’ST3检验。P<0．05被认为有显著差异。
3结果
3．1大鼠旷场实验结果
与正常组比较，模型组大鼠的水平运动、垂直运动得分明显减少，水平运动得分与正常组比较差异明显(P<0．01)，而垂直运动得分与正常组比较有差异(P<0．05)。中药组大鼠与正常组相比，水平运动和垂直运动得分差异不明显，且P>0．05，不具有统计学意义。中药组大鼠与模型组相比，水平运动和垂直运动得分均增加，且P<0．05。结果见表1。

3．2大鼠高架十字迷宫测试结果
与正常组比较，模型组大鼠的OE％以及OT％明显降低，与正常组比较差异明显(P<0．01)。中药组大鼠与正常组相比，OE％以及OT％差异不明显，且P>0．05，不具有统计学意义。中药组大鼠与模型组相比，OE％以及OT％均增加，且P<0．05。结果见表2。

4讨论
现有的焦虑模型大致可分为新异环境应激模型(包括高架十字迷宫模型、旷场实验、明暗箱穿行实验等)和冲突实验模型(包括Vogel饮水冲突模型等)。实验所采用的Vogel饮水冲突模型是一种条件化模型，模型不可避免的还有电击刺激应激成分，使得心理应激减少，而躯体应激比例增大是它的主要缺点。而天敌暴露法属于新异环境应激模型中的非条件化模型，利用大鼠对新奇环境既想探索有感到恐惧的矛盾心理而设计的。实验证实，将大鼠间接暴露于猫面前，天敌会对动物进行攻击，但是不会造成躯体方面的影响，由此可能造成焦虑水平提高。但模型中，天敌攻击频率、次数均为随机出现，不能保持较平均的水平，对心理应激的程度有一定的影响。所以将2个模型融合互补，既减少躯体应激比例，又能提供较稳定的应激水平。旷场实验是一种评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为和紧张度的方法。i贝4试结果，模型组大鼠在联合应激的方法下活动性明显降低，对未知环境的探究行为减少程度较大，证明此复合模型，在对大鼠探索性行为方面比活动性影响程度要深。而在丹栀逍遥散组与模型组的比较中，能够明显的改善焦虑动物在自主活动与探索行为的主动性，减少因焦虑所造成的应激水平下降。而高架十字迷宫实验所唤起行为的心理成分包括陌生恐惧、探索及趋避冲突，是目前使用最广泛识别焦虑程度变化的方法。测试结果显示复合焦虑模型组大鼠的焦虑程度升高，证明此模型较为可靠的模拟了与临床相符的一定焦虑程度。而运用丹栀逍遥散的中药组大鼠在高架十字迷宫测试下，能够明显改善焦虑行为，并具有一定的缓解作用，证明丹栀逍遥散具有抗焦虑作用。

综上所述，饮水冲突联合天敌暴露应激模型在一定程度上减少了躯体应激在整体所占比例，降低了躯体应激对心理应激的干扰。实验结果表明了模型的可靠性，在动物探究行为、活动度、焦虑程度等方面具有一定效果。而运用丹栀逍遥散对其进行干预后，可大大改善应激动物焦虑行为，并能够达到较为正常的水平。证明丹栀逍遥散在治疗广泛性焦虑障碍方面，有一定的干预作用，具有深入研究的价值。