异丙酚和氯胺酮减轻电休克诱发的大鼠认知障碍

摘要：目的该文通过观察异丙酚和氯胺酮对电休克（ECT）后WKY大鼠认知和Tau蛋白过度磷酸化的影响，探讨异丙酚和氯胺酮对Tau蛋白过度磷酸化的调节及两者对抑郁大鼠认知的影响。方法采用随机单位组析因设计2个干预因素，即电休克干预（2水平：无处置、施行1疗程ECT）和异丙酚、氯胺酮干预（3水平：注射生理盐水、异丙酚、氯胺酮）的所有组合（2×3析因设计）进行实验。全部ECT处置结束24h内开始Morris水迷宫检测，然后留取各组大鼠海马组织。高效液相色谱法检测海马组织中神经递质Glu含量；Westernblot检测Tau5（总Tau蛋白）、p-PHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262在海马组织中的表达。结果ECT和实验药物均可造成大鼠认知障碍，即延长逃避潜伏期并缩短空间探索时间；ECT和实验药物合用之后，其造成的大鼠认知障碍程度反而减轻。ECT可增加海马中磷酸化Tau蛋白的表达；异丙酚和氯胺酮可使电休克造成的海马磷酸化Tau蛋白的表达增加的幅度降低。结论异丙酚和氯胺酮可使ECT造成的海马磷酸化Tau蛋白的表达增加的幅度降低，从而改善ECT后的认知障碍。

关键词：异丙酚；氯胺酮；电休克；认知能力；Tau蛋白；过度磷酸化

Tau蛋白促进轴突微管的装配和稳定，保持微管间的距离，影响神经细胞轴突的物质运输功能，Tau被异常磷酸化后阻碍微管的组装过程，造成相关神经递质的运输、储存和释放障碍，导致认知损害。

抑郁症是一种常见的、严重的精神疾病，其终生患病率为17.1%。电休克（electroconvulsivetherapy，ECT）是治疗抑郁症的有效的方法，发作时间超过120～180s的ECT与认知损坏高度有关，其原因可能与强应激有关。应激可通过离子型GluR激活来调节Tau蛋白的磷酸化，兴奋性神经传递系统的激活，在应激诱导的海马Tau蛋白的磷酸化中发挥重要的作用。已知，异丙酚和氯胺酮均可不同程度抑制神经兴奋性毒性；那么ECT等应激引起的谷氨酸（glutamate，Glu）升高是否通过上调Tau蛋白的过度磷酸化而造成认知障碍，异丙酚和氯胺酮是否可以阻止该过程，其分子机制和信号转导通路为何，成为关注焦点。

1材料与方法

1.1实验试剂

纯品Propofo（lSigma公司）；纯品Ketamine（Sig-ma公司）；纯品L-谷氨酸（L-Glu，Sigma公司）；小鼠抗牛Tau5单克隆抗体（Millipore公司）；兔抗牛p-PHF1Ser396/404单克隆抗体（Abcam公司）；兔抗人p-AT8Ser199/202多克隆抗体（Invitrogen公司）；兔抗人p-12E8Ser262多克隆抗体（LifeSpanBiosciences公司）。

1.2仪器设备

SuperMazeMorris水迷宫视频分析系统（上海欣软信息科技有限公司）；Harvard啮齿类动物电休克仪（美国自然基金有限公司）；HPLC色谱系统（美国Waers公司）；蛋白电泳系统（美国BioRad公司）；金盘多媒体图像处理系统（成都金盘电子科大多媒体技术有限公司）；光学显微照相系统（Olympus45，日本Olympus公司）。

1.3实验动物

24周健康雌性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠，体质量200～250g，由中国科学院上海实验动物中心提供；WKY大鼠来源于京都大学远系繁殖的Wistar大鼠，其天生对应激具有高反应且行为表现出内源性的抑郁症状，包括精神活动延迟、行动迟缓、快感缺乏等。该特性在WKY雌鼠身上表现更为普遍，故该模型可作为抑郁动物模型。WKY大鼠置于通风良好、12h明暗交替、自由饮水和摄食条件下，每日触摸2min。适应性饲养1周后，进行旷场行为测试，测试均于上午9：00开始，选取水平得分和处置得分的总分30～120s间的48只大鼠。

1.4实验方法

1.4.1动物实验原则所有动物实验均按照美国医学研究协会《实验动物处理原则》以及美国科学学会和国家卫生研究院《实验动物使用和处理指南》进行。

1.4.2实验动物分组采用随机单位组析因设计：每只大鼠视为1个单位，对每单位施加2个处理因素，即ECT处置与否（2水平：无处置、施行1个疗程ECT）和实验药物使用与否（3水平：注射生理盐水、异丙酚、氯胺酮）的所有组合（2×3析因设计）。

1.4.3实验动物干预措施通过随机数字发生器将48只WKY大鼠随机分为6组（n=8）：生理盐水组（静脉注射2mL生理盐水）、异丙酚组（静脉注射2mL5mg/kg异丙酚）、氯胺酮组（静脉注射2mL5mg/kg氯胺酮）、生理盐水+ECT组（静脉注射2mL生理盐水+ECT1疗程）、异丙酚+ECT组（静脉注射2mL5mg/kg异丙酚+ECT1疗程）、氯胺酮+ECT组（静脉注射2mL5mg/kg氯胺酮+ECT1疗程）。

1.4.4ECT处置每次施行ECT前15min静脉注射相应药物，然后于大鼠双颞侧安放电极，采用Har-vard啮齿类动物电休克仪行ECT处理，给予方波（单个正弦半波20ms，50Hz）、电流50mA、持续1s的电刺激，引起大鼠强直阵挛抽搐发作视为治疗成功，隔天1次，共7次，均于上午9：00开始进行。不施行ECT处置的实验组与施行ECT组，在同样时间以同样频率和剂量注射相应药物。

1.4.5Morris水迷宫视频分析系统检测实验大鼠的认知功能（同参考资料）

1.4.6取材在Morris水迷宫测试结束后24h内取大鼠的海马。大鼠左侧海马均分为A、B两份，A份用锡箔纸标记包裹后置于液氮中过夜，然后置于-80℃超低温冰箱中保存，备做Westernblot；B份称重，加入1mL甲醇-水离心液，低温匀浆，取部分匀浆液4℃、10000g离心15min，取上清，滤膜过滤后-80℃保存，待测Glu的含量（组织中含量以μg/g计）。大鼠右侧海马置于4℃的10%多聚甲醛中固定3d，脱水，石蜡包埋、切片（厚度1μm），备行免疫组织化学SP法显色。

1.4.7高效液相色谱法检测神经递质Glu在大鼠海马组织中的含量同参考资料

1.4.8Westernblot检测Tau5（总Tau蛋白）、p-PHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262在大鼠海马组织神经元中的含量取A份大鼠左侧海马，匀浆，取0.2g，经Westernblot及IP细胞裂解液提取蛋白，再用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，据此调节蛋白浓度一致。取等量蛋白样品，用5×SDS加样缓冲液按1∶1（V/V）稀释待测样品，于100℃煮沸5min；另用1×SDS加样缓冲液溶解预染蛋白质分子量标准混合物，置于100℃煮沸3min。取待测标本15μL上样[甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase，GAPDH，1∶200）作为蛋白质上样量的标定]，经SDS-PAGE电泳至预染蛋白质分子量标准所示目的分子量出现为止，用湿法将蛋白条带电转至Immun-blottingPVDF膜，50g/L脱脂奶粉封闭3h，加入相应抗体（小鼠抗牛Tau5单克隆抗体、兔抗牛p-PHF1Ser396/404单克隆抗体、兔抗人p-AT8Ser199/202多克隆抗体、兔抗人p-12E8Ser262多克隆抗体）（1∶200）4℃孵育过夜，相应辣根酶标记IgG（1∶200）37℃孵育2h，DAB显色，金盘多媒体图像处理系统测定阳性条带的积分吸光度值。

1.5统计学方法

采用SPSS17.0软件包进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，对各组样本进行方差齐性检验，经检验方差齐。将各组样本进行析因设计，单因素方差分析各处理因素主效应和交互效应，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1ECT和实验药物对WKY大鼠认知功能的影响

ECT和实验药物（异丙酚和氯胺酮）均可造成认知障碍，即延长逃避潜伏期（ECT：F=25.574，P=0.001；实验药物：F=11.125，P=0.003）、缩短空间探索时间（ECT：F=29.852，P=0.006；实验药物：F=21.193，P=0.001）；但两者合用的影响呈相减效应，即ECT和实验药物合用之后，认知障碍程度反而减轻（逃避潜伏期：F=122.096，P=0.001；空间探索时间：F=113.536，P=0.012），见表1、2。

2.2ECT和实验药物对WKY大鼠海马中Glu含量的影响

ECT可明显增加海马中神经递质Glu的浓度（F=275.182，P=0.005）；实验药物（异丙酚、氯胺酮）对海马中神经递质Glu的浓度无明确影响（F=0.101，P=0.825）；ECT和实验药物合用亦未见交互效应（F=0.402，P=0.712），见表3。

2.3ECT和实验药物对WKY大鼠海马组织神经元中Tau蛋白表达的影响

ECT和实验药物对海马总Tau蛋白（Tau5蛋白）的表达均无明显影响（ECT：F=0.655，P=0.451；实验药物：F=0.041，P=0.935）；而且ECT和实验药物合用亦未见交互效应（F=0.134，P=0.651），见表4及附图。

ECT可增加海马中磷酸化Tau蛋白的表达（p-PHF1Ser396/404：F=38.906，P=0.008；p-AT8Ser199/202：F=178.482，P=0.000；p-12E8Ser262：F=35.634，P=0.000）；实验药物可减少海马中磷酸化Tau蛋白的表达（p-PHF1Ser396/404：F=63.825，P=0.000；p-AT8Ser199/202：F=74.813，P=0.009；p-12E8Ser262：F=101.340，P=0.000）；两者合用的影响呈相减效应（p-PHF1Ser396/404：F=5.264，P=0.014；p-AT8Ser199/202：F=44.712，P=0.001；p-12E8Ser262：F=50.714，P=0.005），即异丙酚和氯胺酮可使ECT造成的海马中磷酸化Tau蛋白表达增加的幅度降低。

3讨论

3.1Tau蛋白过磷酸化与认知及Tau蛋白过磷酸化的信号传导机制

Tau蛋白过度磷酸化可降低轴突转运的效率，神经信号传递的障碍及突触退化，甚至造成神经元凋亡或死亡，从而导致认知损害。本实验证实，认知能力与Tau过度磷酸化有关，表现为Tau蛋白磷酸化程度愈高者认知能力越差。本实验还发现，总Tau蛋白的表达在神经元ECT应激前后没有明显变化，在诸过度磷酸化位点中，Ser199/202的磷酸化程度与ECT应激关系最为紧密，似乎在导致认知障碍的Tau蛋白过度磷酸化机制中扮演主要角色。这可能与Ser199/202位点定位于微管结合区，其磷酸化参与调节Tau蛋白与微管的结合活性有关。

Tau蛋白过度磷酸化的内源性机制是由于脑中Tau蛋白自身的代谢异常导致的；Tau蛋白过度磷酸化的外源性机制是蛋白激酶和蛋白磷酸酶的平衡失调引起的。GSK-3β是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是目前发现最强有力的Tau蛋白激酶，催化Tau蛋白多个位点的磷酸化，其中包括Thr181、Ser199、Ser202、Thr205、Thr212、Thr217、Thr231、Ser396和Ser404。

本实验中观察到ECT后Glu在神经元中的浓度明显升高，与WU等发现应激可激活兴奋性神经传递系统诱导海马Tau蛋白过磷酸化的研究结果一致。而Glu抑制包括Akt等多种蛋白激酶的活性，Akt是GSK-3β的上游调节分子，而GSK-3β是使Tau蛋白发生过度磷酸化的关键磷酸酶，故推测相关信号传导途径如下：ECT应激导致Glu浓度升高→Akt活性抑制→GSK-3β活性升高→Tau蛋白磷酸化程度增加。

3.2兴奋性氨基酸Glu与认知脑内Glu释放过多，过度激动膜电位依赖式GluR导致Ca2+大量内流，激活对Ca2+敏感的各种酶类，产生自由基激活磷酸肌醇环路，使神经元变性，造成认知障碍。ECT后认知障碍与GluR过度激动引起氧化应激、导致海马LTP饱和状态、造成突触可塑性障碍有关。NMDAR的激动可以通过激活GSK-3β、酪蛋白激酶2和肌动蛋白聚合作用以增加Tau磷酸化程度，从而损伤神经元；而NMDAR拮抗剂可从受体水平阻断Glu的兴奋性毒性，从而使得经由GSK-3β增加Tau蛋白过度磷酸化程度的神经损伤过程中断。

本实验结果表明，ECT导致海马中Glu浓度明显上升，说明Glu诱导的兴奋性毒性很可能参与ECT导致的认知功能障碍机制。实验也表明，异丙酚和氯胺酮对海马中神经递质Glu的浓度、海马总Tau蛋白没有明确影响，ECT和实验药物合用亦未见交互效应，提示异丙酚和氯胺酮对海马中Tau蛋白磷酸化的干预，不是通过影响海马中Glu浓度发挥作用，其更可能是作为GluR的阻滞剂而阻断海马中Glu诱发的认知功能障碍。

3.3氯胺酮缓解ECT后学习记忆障碍

本实验发现盐酸氯胺酮单独使用，会导致认知减退，但与ECT合用则可明显减轻ECT后的认知障碍。本实验发现，盐酸氯胺酮对减少海马中Glu的浓度无明显影响，但氯胺酮可以发挥类似GluR拮抗剂的作用，明显减轻兴奋性毒性反应，并减缓Tau蛋白过度磷酸化程度，最终改善认知状况。结合既往研究，推测其机制如下：氯胺酮属于非竞争性NMDA受体拮抗剂，与NMDA受体通道复合物的苯环己哌啶调节位点结合，通过变构调节来干扰兴奋性氨基酸与NMDA受体的正常结合，减轻NMDA受体过度激活所致的氧自由基损伤。氯胺酮还可通过阻断已开放通道及降低通道，开放频率而阻滞NM-DA受体。本研究与LOO等的研究结论一致，LOO认为盐酸氯能够减轻ECT后的认知功能障碍，尤其在ECT后的1周之内效果明显。

3.4异丙酚缓解ECT后学习记忆障碍

本实验发现，异丙酚单独使用会导致学习记忆减退，但与ECT合用则可明显减轻ECT后的学习记忆障碍，这两点与大多数研究一致。实验发现无论施行ECT与否，异丙酚对海马中Glu的浓度无明显影响，但异丙酚与氯胺酮同样具有类似GluR阻滞剂的作用，减缓兴奋性毒性诱发的Tau蛋白过度磷酸化进程，改善ECT后的认知障碍。

结合既往研究，推测其机制如下：①异丙酚的苯环基团可作用于NMDAR的苯环己哌啶结合位点，非竞争性拮抗NMDAR，缩短兴奋性突触后电位持续时间，减少因NMDAR过度兴奋导致的神经元损伤。②异丙酚还可通过升高Akt活性抑制神经元凋亡。③异丙酚直接作为NMDAR阻滞剂而发挥作用，逆转ECT后学习记忆障碍。

来源：上海欣软信息科技有限公司

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