斑马鱼作为经典的脊椎动物模型，在研究配子发生和性腺分化中应用广泛。然而，常用的实验室品系如AB和TU等均丢失了遗传性别决定因子（Wilson, C. A. et al., Genetics, 2014），其两性性腺发育过程均会经历一个早期的“类卵巢”阶段，且生殖细胞发育缺陷往往导致雌性到雄性的性逆转。在已发表的相关文献中，有大量研究将影响斑马鱼卵子发生的基因错误判断为影响性别分化。因此，开发一种具有稳定遗传性别决定机制，能够替代斑马鱼开展生殖细胞发育和性腺分化研究的小型模式鱼具有重要的意义。
稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus, Juji）是一种原产于中国四川溪流的小型淡水鲤科鱼类，自上世纪90年代以来，中国科学院水生生物研究所曹文宣院士团队详细刻画了该物种的生物学特性，并开展了系统的实验动物化研究（王剑伟，曹文宣，2017），目前其被广泛应用于分子毒理学和鱼病学等研究领域。稀有鮈鲫的养殖适应性广、性成熟周期短（通常4个月达性成熟）、产卵量大（一对亲本可产500颗以上受精卵）、可周年产卵且产卵间隔短（间隔仅为4－5天），全基因组测序显示其具有遗传性别决定系统（Hu, X. et al., Science Advances, 2022）。
水生所孙永华团队长期从事鱼类生殖细胞发育与育种技术创新研究。近日，水生所孙永华团队在Communications Biology上发表了题为“Cyprinid Juji (Gobiocypris rarus) as a model fish to study germ cell development and gonadal differentiation”的研究论文，通过构建全时相生殖细胞谱系标记的稀有鮈鲫转基因品系，系统刻画了稀有鮈鲫的配子发生与性腺分化的全时相过程，解析了性腺分化关键节点的二态性表达基因谱式；通过基因敲除与生殖干细胞移植等实验，揭示了关键基因dmrt1在性腺体细胞中特异驱动雄性性腺分化的决定性作用。
研究团队首先克隆稀有鮈鲫的生殖细胞特异表达基因ddx4（原称vasa）的调控元件，构建了稀有鮈鲫转基因品系Tg(ddx4:EGFP-UTRddx4)，实现了从原肠胚至性成熟阶段生殖细胞谱系的全时相示踪。他们发现不同于斑马鱼，稀有鮈鲫中早期原始生殖细胞（PGC）的数目不影响后期性别分化；而受精后20天（20 dpf）转基因品系中性腺的荧光表达强弱直接预示着后续的卵巢和精巢分化。研究团队进一步精细刻画了稀有鮈鲫两性个体的生殖细胞发育轨迹（图1）：在卵巢中，生殖细胞首先经历快速增殖，在25 dpf左右即启动减数分裂；在精巢中，生殖细胞在20 dpf至60 dpf期间均处于增殖中的精原细胞状态，60 dpf之后则快速启动精子发生；最终，雄性个体在约90 dpf达到性成熟产生成熟精子，雌性个体在约120 dpf达到性成熟产生成熟卵子。
图1 全时相生殖细胞谱系标记的转基因稀有鮈鲫及其卵巢与精巢中生殖细胞的发育轨迹
为了揭示性腺分化关键节点的调控基因，研究者选取生殖细胞尚未出现明显分化的20 dpf幼鱼，针对荧光强和弱的原始卵巢和原始精巢进行RNA-seq分析，共鉴定出123个性别二态性表达基因（sexually dimorphic genes, SDGs）。通过单分子荧光原位杂交（smFISH）等技术，揭示了典型SDGs在原始卵巢和原始精巢中的差异表达模式，这其中包括与卵巢分化相关的foxl2l、以及与精巢分化相关的dmrt1、amh等基因（图2）。这表明在生殖细胞分化之前，雌雄性腺的基因表达程序已呈现显著差异。
图2 20 dpf幼鱼性腺中典型性别二态性基因的单分子荧光原位杂交（smFISH）分析研究者进一步构建dmrt1基因敲除的稀有鮈鲫品系，发现所有dmrt1突变体均发育为可育的雌性，表明dmrt1是雄性发育所必需的。为了回答是性腺体细胞还是生殖细胞中表达的dmrt1决定了雄性命运，他们利用团队建立的生殖干细胞移植技术（Zhang, F. et al.,Science China Life Sciences, 2022），分离Tg(ddx4:EGFP-UTRddx4)雄鱼的精巢生殖干细胞（原称“精原干细胞”），移植至内源生殖细胞剔除的dmrt1突变受体中，结果所有受体鱼依然发育为雌性，且能够产生100%来源于供体生殖干细胞的卵子（图3）。以上研究表明，受体性腺体细胞中dmrt1功能的丧失足以驱动性腺的雌性化和供体精巢来源的生殖干细胞向卵母细胞分化，亦即体细胞的命运逆转可以重编程生殖细胞的命运。
图3 生殖干细胞移植实验揭示体细胞dmrt1缺失决定生殖细胞向卵子分化
总之，该研究成功建立了生殖细胞谱系全时相标记的稀有鮈鲫品系，并揭示了稀有鮈鲫作为研究性腺分化与配子发生鱼类模型的巨大优势。以上论文，中国科学院水生生物研究所孙永华研究员为通讯作者，博士生苏乃克为第一作者，已出站的博士后任志勤为共同第一作者。相关工作得到了国家杰出青年科学基金、国家重点研发计划、湖北省自然科学基金创新群体等项目资助。文中所用到的单分子荧光原位杂交试剂盒（CZkit1）由国家水生生物种质资源库国家斑马鱼资源中心提供，所构建的转基因及基因敲除品系已保藏于该中心，并对学术界提供。
参考文献
1.Wilson, C. A. et al.Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics198, 1291-1308, (2014).
2.王剑伟，曹文宣. 中国本土鱼类模式生物稀有鮈鲫研究应用的历史与现状. 生态毒理学报 12 (2), 20-33, (2017).
3.Hu, X. et al.Genomic deciphering of sex determination and unique immune system of a potential model species rare minnow (Gobiocypris rarus). Sci Adv8, eabl7253, (2022).
4.Zhang, F. et al.Surrogate production of genome-edited sperm from a different subfamily by spermatogonial stem cell transplantation. Sci China Life Sci65, 969-987, (2022).
