2021年，经济合作与发展组织（OECD）正式发布了一项具有里程碑意义的测试指南——第497号（TG 497），首次将一套完整的综合体外测试方案纳入国际毒理学评价体系，该方案用于化学品的皮肤致敏性评估，被视为可完全替代动物实验。紧接着，OECD于2022年又发布了另一项综合体外测试方案TG 467，用于评估眼部腐蚀与刺激。尽管目前仅有这两项指南作为完全替代相应动物实验的方案被纳入官方毒理测试评价体系，但它们的推出仍标志着在部分领域，非动物方法已由“辅助性工具”跃升为决策层面的主导手段，实现了特定毒理终点的完全替代。但正如TG 497的成功案例所揭示的那样，实现“完全替代”的道路并非坦途——每一个被采纳的替代方案都需要在对生物机制深入理解的基础上，实现方法的标准化、完成多中心验证及确保替代方案与人体真实反应的高度一致性。因此，目前替代成功更多是个别突破而非普遍现象。
在了解TG 497前，先简要了解下皮肤致敏的过程和机理：
化合物引发皮肤致敏反应主要涉及三个连续的生物学过程。
首先，多数低分子质量（通常小于500道尔顿）的化学物质本身不能被免疫系统直接识别，因此它们需首先与皮肤中的蛋白质发生共价结合，形成所谓的半抗原复合物。这种修饰后的蛋白质结构被免疫系统识别为“外来”，成为真正具有免疫原性的抗原，进而触发迟发型（IV型）变态反应，即皮肤致敏反应的起点；
第二步是角质形成细胞的应激激活。在接触化学物质后，表皮中的角质形成细胞会被刺激而激活，释放一系列促炎因子，如各种白细胞介素和胸腺基质淋巴细胞生成素等。这些细胞因子的释放不仅增强局部炎症反应，还具有重要的免疫信号功能，可吸引并激活树突状细胞及朗格汉斯细胞向接触部位迁移；
第三步是树突状细胞的激活与抗原提呈。这些抗原递呈细胞在接触刺激部位摄取半抗原复合物后，成熟并迁移至区域性淋巴结，在那里与T细胞相互作用，完成抗原提呈，最终形成免疫记忆。该免疫记忆使得个体在后续暴露相同化学物质时迅速出现过敏反应，表现为典型的过敏性接触性皮炎。
从皮肤首次接触某种化学物质，到反复暴露后诱发过敏性接触性皮炎的全过程，在现代毒理学中被统称为“有害结局通路”。该通路由多个生物学过程构成，其中的关键环节被称为“关键事件”。由上文可知，皮肤致敏的有害结局通路包含三个关键事件，即（1）半抗原形成；（2）角质形成细胞的激活和（3）树突状细胞激活。在所有已知的“有害结局通路”中，皮肤致敏性“有害结局通路”是建立最早、机制最明确，且相对容易进行体外模拟的免疫反应，因此成为了替代方法开发的突破口。
在传统毒理学评估中，皮肤致敏性通常依赖动物整体反应模型进行判断，代表性方法包括：（1）豚鼠皮肤致敏试验，用于综合评估致敏起始阶段与激发阶段的反应；（2）局部淋巴结试验，聚焦于皮肤致敏阶段。以局部淋巴结试验为例，一次标准实验需消耗至少20只小鼠。据统计，截至2018年，仅在欧盟REACH制度实施框架下就已有超过33,000只小鼠被用于皮肤致敏性测试。
那么TG 497中所列的动物替代技术是如何实现的呢？
TG 497 所采用的“三选二策略”是基于皮肤致敏性有害结局通路中的前三个关键事件所构建的一种综合性评估方法，旨在判定受试化学物是否具有皮肤致敏潜力。
首先，直接肽反应实验（DPRA，OECD TG 442C）用于评估第一关键事件，即被测物是否具有与蛋白质共价结合形成半抗原的能力。该方法采用合成的含半胱氨酸或赖氨酸残基的肽段作为模型受体，与被测物共同孵育后，通过测量肽的消耗率评估其反应性。反应结束后，利用高效液相色谱对肽段残留量进行定量分析。若肽的消耗显著，说明化学物能与肽发生共价反应，具备潜在致敏性，从而完成对半抗原形成关键事件的评价。
其次，角质形成细胞激活试验（KeratinoSens™, OECD TG 442D）用于评估第二关键事件——角质形成细胞的氧化应激与促炎反应激活，该事件在有害结局通路中处于信号放大的早期阶段。KeratinoSens™方法基于转基因人永生化角质形成细胞系HaCaT，该细胞稳定表达一个由抗氧化反应元件驱动的荧光素酶报告基因。当潜在致敏物质刺激角质形成细胞时，会引发细胞内应激响应，从而启动荧光素酶表达。通过测定荧光素酶活性，即可定量评估化学物对该通路的激活能力，进而判断其是否诱导角质形成细胞释放促炎因子。
最后，人源树突状细胞活化实验（h-CLAT，OECD TG 442E）模拟有害结局通路中的第三关键事件——树突状细胞的激活。在致敏过程中，被测物通过局部炎症信号激活树突状细胞，后者在抗原识别、处理及向T细胞提呈抗原的过程中起到桥梁作用。h-CLAT方法使用人急性单核细胞白血病细胞系THP-1作为树突状细胞的替代模型。当致敏化学物作用于THP-1细胞后，若具免疫激活能力，将诱导其表面共刺激分子（如CD86和CD54）表达上调。通过流式细胞分析检测这些表面标志物的相对荧光强度变化，即可判断化学物是否具备激活免疫系统的潜能。
TG 497通过整合上述三种机制互补的体外方法，从生物学不同层面综合评估皮肤致敏性。只要任意两项测试结果一致，即可做出科学、可靠的致敏性判断，从而实现在此毒理终点上对动物实验的完全替代。这三项方法各自针对皮肤致敏有害结局通路中的不同关键节点，组合使用时增强了判断的稳健性和预测一致性。
TG 497被正式写入OECD指南前，其开发团队以及欧盟替代方法验证中心、美国替代方法验证协调委员会和日本替代方法验证中心都对其评估能力进行了验证，并与传统动物实验方法如局部淋巴结试验做了对比，结果显示TG 497在多个核心指标上全面优于局部淋巴结试验。具体表现为：在敏感性上，TG 497达到了87%，相比之下局部淋巴结试验为72%，证明前者在识别真正致敏物方面表现更优；在特异性方面，TG 497为88%，也明显高于局部淋巴结试验的75%，证明其在排除非致敏物时误判更少；在准确率上，TG 497为87.5%，也高于局部淋巴结试验的73%，证明其在整体预测效能上表现更加平衡；更为关键的是，与人体不良反应数据的一致性上TG 497达到了“非常高”，而局部淋巴结试验仅为“中等偏高”，这表明TG 497在临床相关性上更具优势。
综上所述，TG 497不仅在科学性能上更为出色，而且由于其不依赖动物实验、与人体数据一致性更高，因此得以成为目前首个被国际监管机构OECD采纳的完全替代皮肤致敏性动物试验的标准体外测试方案。这一指南的颁布也标志着毒理学替代方法从“辅助”迈入“决策级”应用的关键进展。
尽管TG 497的成功被视为替代毒理学领域的重要里程碑，但其背后反映出的研发过程也暴露了动物替代方法开发的诸多难点与局限。之所以能取得突破，首先因为皮肤致敏反应是目前有害结局通路建立最完善的毒理路径之一，机制简单、事件明确、模拟容易。相比之下，神经毒性、免疫毒性、内分泌干扰等终点路径复杂，机制不明确，至今尚无可实现完全替代的体外组合方法。其次，TG 497研发成功的核心优势还在于拥有有大量来自因斑贴测试、临床案例和职业暴露的人体皮肤致敏不良反应数据可用于方法验证。而多数其它毒理领域仍严重依赖于动物实验数据，缺乏可比对的人体资料，从而限制了相应替代方案的实际验证路径。即便如此，TG 497成功进入OECD指南也历经了漫长的验证、标准化与互认过程。三项子方法最早提出可追溯至2006年前后，但直至2015年才以单独测试方法形式被 OECD 采纳，2021年方整合为 TG497——整个流程耗时逾10年。
此外TG 497在皮肤致敏评估中仍存在化学品适用范围的盲区：它仅适用于小分子化学品，对金属离子、复杂混合物、亲水性或高反应性物质尚不适用；同时，也不适用于易干扰测试系统稳定性的强刺激性或腐蚀性化合物。
可以说，TG497 的诞生既是一道分水岭，也是一面镜子：一方面，它首次证明“综合测试方案”完全可以获得监管层面的认可，为 OECD 体系内其他毒理终点开发类似方法树立了范式；另一方面，它警示我们，唯有深入掌握生物机制、系统整合多源数据并实现方法标准化与多中心验证，替代策略方能真正落地。更进一步，TG497 的成功表明，替代路径更适用于机制清晰、易于体外模拟且人体数据相对充足的毒理终点。总之，替代并非简化，不是单凭热情就可以“一蹴而就”的，而是在更高科学规范要求下，通过持续演化与完善才能够得以实现；同时，其研发仍离不开动物实验与人体反应数据的对照与支撑。因此，尽管TG497 为全面替代动物实验开了一个好头，但在所有领域都实现这一目标仍有漫长的科学探索与制度建设之路要走。
【本文得到了 “中国科学院战略生物资源专项实验动物平台项目” 的支持。】
