目的 通过原核表达和纯化得到树鼩Vasorin （VASN） 重组蛋白，以此蛋白免疫小鼠制备抗树鼩VASN单 克隆抗体，并初步评估其应用价值。
方法 采用反转录聚合酶链式反应 （reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 法体外扩增树鼩 VASN 基因全长序列，将树鼩 VASN 基因片段插入到 pET-30a 载体中，构建 pET-30a-VASN重组质粒，用BamHⅠ和SalⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定，并通过测序进一步鉴定其正确性；将测 序 正 确 的 重 组 质 粒 转 化 至 BL21 （DE3） 感 受 态 细 胞 中，利 用 异 丙 基- β -D-硫 代 半 乳 糖 苷 （isopropyl β -Dthiogalactoside，IPTG） 诱导表达重组蛋白 VASN；通过 SDS-PAGE 分离蛋白 VASN，并利用 KCl 纯化重组蛋白 VASN；用纯化的重组蛋白 VASN 对 BALB/c 小鼠进行 4 次免疫，并通过酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 检测小鼠血清抗体效价；取血清抗体效价达到1∶10 000以上的小鼠的脾脏细胞 与骨髓瘤细胞进行细胞融合，先利用含黄嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶核苷 （hypoxanthine-aminopterin-thymidine， HAT） 的培养基筛选杂交瘤细胞，随后通过ELISA筛选出能够分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株，并通过有限稀 释法进行亚克隆，获得单克隆杂交瘤细胞株；通过腹水诱生法制备大量VASN单克隆抗体，利用rProtein G纯化抗 体，采用ELISA和蛋白质印迹法检测单克隆抗体的结合常数和体外反应的特异性。
结果 成功扩增出树鼩VASN基 因并构建了树鼩pET-30a-VASN重组质粒，重组质粒经测序得到的序列与树鼩VASN目的基因序列完全一致；重组 蛋白 VASN 主要以包涵体的形式存在，纯化后的蛋白纯度达到 90%，符合后续免疫实验的要求；利用重组蛋白 VASN 4次免疫小鼠后，小鼠血清抗体效价达1∶729 000；利用杂交瘤技术及有限稀释法获得单克隆阳性杂交瘤细 胞株，通过腹水诱生和纯化得到单克隆抗体，ELISA测定单克隆抗体的结合常数值达2.59×107 L/mol；蛋白质印迹 法结果显示，树鼩VASN单克隆抗体能与树鼩VASN重组蛋白结合，与猪视黄醇结合蛋白4重组蛋白、人源VASN- 富含亮氨酸重复序列重组蛋白以及牛血清白蛋白均无结合反应；而抗树鼩VASN单克隆抗体能特异性识别树鼩心 脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉组织中的VASN蛋白，且条带明显、背景清晰。免疫组织化学检测结果显示， 该单克隆抗体可以识别蛋白VASN mRNA表达水平较高的树鼩脾脏、肺脏和树鼩永生化成纤维细胞中的VASN蛋 白。
结论 成功制备了抗树鼩VASN的单克隆抗体，该抗体可用于树鼩永生化成纤维细胞、树鼩脾脏组织和肺脏组 织的免疫组织化学检测，为进一步探索VASN在树鼩模型中的功能提供了重要的工具。
