目的 探讨乔松素( Pin)对小鼠黑色素瘤细胞B16凋亡、迁移的影响及其与DAAM2/ Wnt/ β -catenin信号轴的关系。
方法 体外通过CCK8法筛选抑制小鼠黑色素瘤细胞B16活力的中药单体;通过流式细胞术和划痕实验检测筛选出的Pin对黑色素瘤细胞B16凋亡和迁移的影响;利用RNA-seq测序结合GEPIA 数据库分析Pin可能作用的核心基因,并采用实时荧光定量PCR( qPCR)和Western blot法验证 DAAM2 和 Wnt/ β-catenin信号通路相关蛋白Axin2、 p-GSK3β、 p-β-catenin 的表达水平。 通过转染过表达DAAM2质粒进行回复实验。 体内建立小鼠黑色素瘤模型,给予Pin低、高剂量( 10 mg/ kg、 30 mg/ kg)灌胃干预,观察小鼠黑色素瘤的生长情况。 Western blot检测Pin对黑色素瘤组织中DAAM2、 Axin2、 β-catenin、 p-GSK3β表达的影响,进一步明确Pin对小鼠黑色素瘤进程的影响。
结果 Pin显著促进黑色素瘤细胞B16 的凋亡( P< 0 . 001) ,抑制其迁移速率( P<0 . 01 ,P < 0 . 001) ;RNA-seq和GEPIA分析提示DAAM2为关键靶点。 qPCR 和Western blot 结果显示Pin能够显著降低DAAM2 的mRNA和蛋白表达( P< 0 . 05 ,P < 0 . 01 ,P < 0 . 001) ,并下调Wnt/ β-catenin 信号通路相关蛋白p-GSK3β、 p-β-catenin和Axin2 的表达水平( P< 0 . 001)。 体内实验表明,高剂量Pin可明显抑制小鼠黑色素瘤的生长和瘤重,同时降低瘤组织中 DAAM2、 Axin2、 β-catenin、 p-GSK3β 的表达( P< 0 . 05 ,P < 0. 01) ,DAAM2过表达可逆转Pin对DAAM2/ Wnt/ β-catenin信号轴的作用。
结论 Pin可通过下调DAAM2/ Wnt/ β-catenin信号轴,促进黑色素瘤细胞凋亡、抑制其迁移,并抑制小鼠体内黑色素瘤生长。
